Neuron一作分享 | 浙大张斌：为什么我们历经失败却并未失败？|浙大

　　定格思想飞起的一瞬分享科研起飞的时光

　　分享人：张斌博士，浙江大学基础医学院神经科学研究中心段树民教授课题组博士后。研究兴趣为神经内分泌与神经免疫的互作与调控。

　　张斌所在的浙江大学脑科学与脑医学学院段树民院士/高志华教授团队与华中科技大学武汉光电国家研究中心龚辉教授团队合作，首次解析了下丘脑-神经垂体内分泌系统的三维精细结构。相关研究发表于Neuron杂志。

　　“张斌，你知道神经垂体和视网膜吧？”

　　“知道啊？为什么这么问？”

　　“你知道神经垂体和视网膜都属于中枢神经系统吗？”

　　“啊？真的吗？”

　　“果真被遗忘在角落了，我们就从神经垂体入手如何？”

　　这是五年前的一段随意的聊天，发生于开完会返回学校的车上。没想到那次聊天，竟然慢慢成为我从博士延续到博后的重要课题之一，一段反复被困难和失败蹂躏的经历。

　　脑图谱上，缺了一“角”

　　将神经科学列为日新月异的前沿学科，想必很少人会反对。然而在好奇心驱动下，我们调研了文献，居然发现神经垂体研究领域很多问题仍然停留在上世纪八九十年代，存在诸多空缺。尽管在病毒示踪、光遗传学、药理遗传学和钙成像等强大手段的加持下，神经科学的新发现、新突破日益涌现，但期刊论文、教科书上竟然连下丘脑和神经垂体连接结构的准确插图都没有。甚至，我们常伴手边的大鼠、小鼠脑图谱都缺失了神经垂体。

　　结构决定功能，这是老生常谈的规律。垂体是整个神经内分泌系统的核心节点，很难想象，连基本的位置、环路连接都不清楚，如何进一步开展神经内分泌的功能研究。因此，解析下丘脑和神经垂体的环路连接成为了我们第一个重要问题。以下，我不讲课题意义，不讲实验设计，只想分享探索初期遭遇的历次困难与失败为什么没有最终导致课题的失败。

　　悬停的手术刀：神经垂体在哪？

　　第一个挑战来自研究思维和技术的陌生。硕士期间，我的课题方向偏重于发育，掌握的技术也集中于分子、生化、细胞学研究手段，现在要关注更加宏观的环路研究，算是半路出家，从零开始。课题组两位优秀的师兄教会了我基本的立体定位注射技术，是我入门环路的引路人。

　　垂体位于颅底最深处，成人垂体约蚕豆大小，大鼠垂体约相当于一粒米，小鼠垂体则更难操作，所以大鼠成为我们实验动物的首选。临床上进行垂体手术时，常规从鼻腔入路。考虑到小鼠的特点，从鼻腔和口腔入路完全缺少可行性。越简单，越有效。我们讨论之后，决定从颅顶竖直穿过整个脑击中颅底的神经垂体。当我掌握了技术，准备大干一场时，却发现并没有成形的方案。脑图谱上没有标注神经垂体的坐标，空有一身武艺，却无用武之地。

　　显然，想办法确定其坐标首当其冲。比起小动物核磁成像，解剖可能是最笨却直接的办法，本着能省则省的原则，我开始访求等待安乐死的老年大鼠以解剖垂体，感谢为那些为了课题探索和开展献出生命的实验动物。经过反复解剖分离，游标卡尺测量，我获得了神经垂体坐标的区间，开始预注射，每只动物我都会用不同的坐标注射几种不同的颜色，达到一物多用的目的。

　　三个多月已经过去了，我没有采集到任何数据，更为可怕的是在这个过程中动物无意义的牺牲让我因为内疚和挫败而累积了越来越强烈的对生命的畏惧和对自我的怀疑。因而，可想而知，当我第一次在神经垂体看到注射的针道时，手里的镊子将我的激动颤抖了一地，随之而来的心安刹那扫清了心里的雾霾。然而，半路出家的另一个缺陷——经验不足——迅速展现，当我为正式实验做准备时，突然意识到，预注射摸索坐标用的老年鼠，体重几乎是标准实验鼠的1.5倍，意味着脑的尺度和神经垂体的坐标都迥异于标准鼠。还好，有了之前的经验教训，我用了不太多的时间，就调整出标准体重实验鼠神经垂体的坐标。

　　N种病毒示踪工具，一一排除

　　时间来到了2016年4月，学到了手艺，了解了对手，下面需要挑一件趁手的兵器。神经垂体的特别之处在于，不同于中枢神经系统其他部分，这里只有轴突，却没有神经元的胞体；只有神经末梢，即突触前，却没有经典的突触后结构。因而，神经垂体可谓逆行示踪的绝佳起点，不用担心逆行示踪染料或者嗜神经病毒可能感染局部胞体的干扰。当时，一种犬腺病毒CAV是学界较为常用的逆行示踪嗜神经病毒，我们首选的方案也是向神经垂体注射CAV，示踪下丘脑与神经垂体的连接。等待病毒表达的过程恰如等待高考放榜，而高考对大多数人而言，结果都不尽人意。我是大多数人之一，期待能上985，结果去了新东方——在小鼠上比较稳定的CAV，在大鼠的表达效果和示踪效率，与“差强人意”都相去甚远。

　　果然，想走捷径躲避的障碍，会以另一种形式跟我们遭遇。接下来的大半年的时间，已经不仅仅是一波三折，我们逐一尝试了能买到的各种不同的示踪工具，包括CTB、Fluoro-Gold、Retrobeads等，甚至改造过的狂犬病毒RV、伪狂犬病毒PRV等。然而，残酷的结果给我的实验方案批注了三个字——“排除法”，把列表中的每一个可能都排除后，仍无兵器可用。

　　好在自助者天助之，2016年10月，Neuron杂志发表了霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的一项工作，他们开发了一种全新的高效逆行示踪病毒工具——Retro-AAV。我们心中再次燃起希望，并尽快申请了授权，开始新一轮的试验。是的，因为结果不明确，而且，很可能再次失败，我认为“试验”比“实验”更确切。不过，这次的结果让我们异常振奋，萤光亮度和示踪效率远超以往任何一种方案。日后，沙漠中的这一点绿洲，不负众望地繁茂生长，几乎构成了我们这篇工作的基石。

　　捷径与障碍

　　此后，课题一度很顺利，直到我再次感受到科研的恶意，想走捷径躲避的障碍，会以另一种形式再次跟我们遭遇。不同于目前非常成熟，多种多样的转基因小鼠品系，国内外转基因大鼠品系屈指可数。而我们一开始便选择了大鼠，希望基于细胞类型特异性开展功能研究，便无法摆脱对转基因大鼠的依赖。除非，构建细胞类型特异性的病毒。接触过转基因动物和病毒构建的砖友应该明白，两者的时间成本截然不同——前者少则七八个月，多则一年；后者大约七八个周。于是，我们欣然采纳了构建病毒的方案。此中细节，按下不表，总之就是“捷径和遭遇”的升级版——病毒在大鼠脑内表达特异性很差，根本无法满足实验需求。最终，绕了一圈回到原点，几乎没有收获，不得不开始与公司合作构建转基因大鼠。

　　我还想再啰嗦一下，关于捷径，要从长远考虑，没有把握的捷径只会制造其他障碍；关于障碍，感觉自己破不开要放弃了，再坚持一下，成功与失败的距离有时没那么远；关于失败，确信当前方案行不通时，分析原因，做出调整，不做调整的尝试不过是用努力感动自己，却注定迎来再次失败。

　　文献、细节与交流

　　之后的故事，拓展了好多，有兴趣可以大致翻一翻我们的文章。我想，在这里介绍偏学术的问题并不合适，不继续赘述。但是这几处经验却值得多说几句：

　　一、查阅文献，不要局限于近十年、二十年的文章，我们中途偶然读到五六十年前就有学者尝试类似的探索，着实吓了一身冷汗，好在关注的问题和我们有所不同，而且时代的局限性决定了当时能够达到的天花板。但是，在经典文献中发现未解问题，以新的手段解答几十年前被无奈搁置的谜题，同样具有非常重要的意义。

　　二、关注细节，多和老师们讨论原始数据，虽然对课题最了解的理应是主导课题的同学们，但老师们学富五车，知识面的广度与同学们不可同日而语。如果说同学精于发掘课题中的趣味点，则老师善于联系趣味点，组织成更吸引人的故事。况且，老师们经验老道，眼光毒辣，对细节可能更加敏感，我们课题的几个重要转折点都基于高老师和段老师回顾原始数据发现的细节。借此机会，感谢我博士导师高老师和博后导师段老师，师恩如山方能包容我用五年慢慢磨完这个课题。

　　三、多做交流，在保证课题核心不泄露的前提下，与其他同专业、跨专业的同行深入讨论，不仅能碰撞出火花，而且能够吸纳资源，促进合作，从不同角度拓展、加深课题研究，如果有幸遇见学界大神或是杂志编辑，更是推销研究成果和获得批评建议难能可贵的机会。也感谢课题开展中给与建议和帮助的老师和同学们，需要感谢的太多，不一一列举。

　　感谢幕后英雄

　　末尾，我要特别感谢幕后英雄——在课题开展中做出伟大牺牲的实验动物——它们用自己弱小的身躯，整个的一生奉献给了我们对未知的探索，是值得人类尊敬的实验伙伴。我们的每一寸前行，都将感恩于它们的生命，它们不可磨灭的、不可替代的贡献。