“三胎”政策公文的发布及正式推行，引发了社会各界的广泛讨论，也让“母婴健康”再次得到大众关注。
大家都知道，妈妈们妊娠期的代谢状态会影响宝宝出生后的长期健康，而宫内高血糖暴露除了会增加后代代谢疾病的发病风险以外，甚至还会影响儿童的神经系统发育，损害认知能力[1]。
而近日，来自上海交通大学、复旦大学、中国医学科学院、浙江大学的合作团队在《自然》出版旗下期刊《转化精神病学》上发表了最新研究结果，更是发现宫内高血糖暴露可能影响两代雄性后代的记忆能力[2]。
既往研究已经证实，高血糖会影响大脑形态和功能改变，并导致海马体细胞凋亡[3]。但母体妊娠期糖尿病（Gestational Diabetes Mellitus，GDM）对后代认知能力的具体影响及其生物学机制仍在探索当中。
已有动物实验表明，宫内高血糖暴露会影响大鼠海马体胰岛素样生长因子和胰岛素受体的调节能力[4]，母体糖尿病还会降低子代大鼠海马和小脑皮质发育过程中突触素的表达[5]。而宫内高血糖暴露的不利影响是否存在代际效应，是否影响再下一代的生长发育，也是科学家们关注的方向。
表观遗传学是近年来颇受关注的基因调控机制，能在不改变DNA序列的情况下调节生长发育过程中组织特异性基因表达。
复旦大学丁国莲教授团队前期研究发现，宫内高血糖改变了子一代（F1）胰岛印记基因的DNA甲基化水平，并通过F1生殖细胞进一步传递给子二代（F2）[6]。因此他们推测，GDM宫内高血糖环境的影响也可能通过F1生殖细胞DNA甲基化传递给后代，影响F2海马发育或功能，导致认知障碍。该团队前期研究也发现，雄性后代比雌性后代更容易受到代际效应的影响，因此在这项研究中重点关注雄性后代。
首先，研究团队构建了GDM孕鼠模型，与对照组（C）孕鼠同期自然分娩。GDM子代小鼠由血糖正常雌性哺乳。F1-C雄鼠与F1-C雌鼠交配获得F2-C子代，F1-GDM雄鼠与F1-C雌鼠交配获得F2-GDM子代。（图2）
图2--动物模型构建示意图随后对两代小鼠进行认知行为测试。
旷场行为测试（Open Field，OF）通过观察实验动物在新异环境中某些行为的发生频率和持续时间及尿便次数，探究实验动物的自主运动行为、探索行为和焦虑程度。
Y迷宫测试（Y-maze）通过记录实验动物在Y型迷宫中从迷路到学会标准行走路径所需的训练数，来评价空间位置感及方向感的学习记忆能力。
新异物体识别测试（novel object recognition，NOR）利用动物对新奇物体的天生探索倾向，通过观察实验动物探索新异物体的时间，来反推评价动物的记忆能力。
他们发现，在OF实验正常的探索活动和焦虑水平前提下，F1-GDM小鼠在Y型迷宫实验中自发变化较对照组更少，提示空间记忆受损（图3-c）；F1-GDM小鼠在NOR测试中也显示出显著的记忆缺陷（图3-d）。与F1小鼠相似，F2-GDM小鼠在Y迷宫测试中也表现出明显的空间记忆缺陷（图3-f）。提示宫内高血糖对F1、F2雄性子代的空间记忆有损害作用。
图3 --（c）F1-GDM小鼠在Y型迷宫实验中自发变化减少；（d）F1-GDM小鼠在NOR测试中得分较对照组显著降低；（f）F2-GDM小鼠在Y型迷宫实验中自发变化显著少于对照组。那么到底是什么原因引起了小鼠的记忆缺陷呢？
研究人员猜测，这或许与海马体这个认知过程的关键结构有关。于是他们通过Microarray微阵列方法，检测GDM组与对照组的海马基因表达变化。
F1-GDM与F1-C相比，共有451个差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）。基因集富集分析法（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）结果显示，F1-GDM小鼠轴突导向和树突延伸的调控基因表达降低，GO富集分析结果及热图也显示GDM组与对照组认知相关基因的表达有显著差异（图4）。说明宫内高血糖改变了F1代雄鼠海马体神经发育和突触功能方面的基因表达模式。
图4--F1代雄鼠海马体认知相关基因表达存在显著差异。紧接着他们对F1雄鼠精子进行DNA甲基化测序，发现宫内高血糖暴露引发了64658个差异甲基化位点（differentially methylated loci，DML），包括大量CpG岛及其邻近区域的改变。
GO富集分析也发现了两组小鼠精子在“神经元发育”、“神经元分化”、“器官分化”等方面的存在大量差异甲基化基因（differentially methylated genes，DMG）（图5）。说明F1-GDM组精子与对照组存在基因甲基化差异。
图5 -- F1-GDM雄鼠精子在“神经元发育”、“神经元分化”、“器官分化”等方面与对照组存在差异甲基化基因。那么这些基因甲基化差异又对子二代产生了什么影响呢？
为了探索宫内高血糖暴露对转录重编程的代际影响效应，该团队对F2雄鼠海马体进行转录组微阵列分析。发现F2-GDM雄鼠“树突延伸”相关基因的表达调控也受到明显抑制。两组间的DEGs也主要富集在“突触组织”、“突触后膜”和“神经元-神经元突触”组别。且F2代比F1代显示出更多的认知相关DEG（图6）。说明宫内高血糖也改变了F2雄性后代海马体的基因表达模式。
图表 6-- F2-GDM小鼠海马基因表达在“突触组织”、“突触后膜”和“神经元-神经元突触”方面与对照组存在明显差异。
最后研究者比较了F1精子DMG与F2海马差异表达基因结果，发现二者存在高度重叠。与各自的对照组相比，F1-GDM和F2-GDM小鼠中有106个相同基因上调，117个相同基因下调，且两代间所有基因均以相同方向发生改变（图7）。
图7 -- F1-GDM与F2-GDM海马差异表达基因存在高度重叠。他们通过RT-qPCR分析进一步验证了最具生物学意义的基因，如调节海马突触可塑性和学习的基因（Camk2b和Drd1）、调节谷氨酸受体密度和活性的基因（Dlgap1和Tanc1）、神经源性Wnt信号通路（Wnt5a和Atp6ap2），以及其他一些与海马功能相关的基因（Akap7、Tubb2b、Map1b和Gpr88）等（图5b）。
这些结果说明，宫内高血糖导致两代持续且一致的转录组学变化，这可能影响海马突触的发育及功能，并导致记忆障碍。
图8 -- F1-GDM与F2-GDM雄鼠在重要认知功能基因表达上变化一致。该研究首次揭示了宫内高血糖对子代认知和记忆的代际影响及其潜在分子机制，证实宫内高血糖暴露会引起F1代成年精子的甲基化修饰改变，并影响两代海马体发育，导致两代后代的认知功能障碍。
说明表观遗传学改变可能在GDM诱导的神经发育异常的代际传递中起重要作用。为后续进一步明确宫内环境对后代发育影响的机制研究提供了新的思路与证据。
参考文献：
1. Bytoft B, Knorr S, Vlachova Z, et al. Long-term Cognitive Implications of Intrauterine Hyperglycemia in Adolescent Offspring of Women With Type 1 Diabetes (the EPICOM Study). Diabetes Care. 2016;39(8):1356-1363. doi:10.2337/dc16-0168
2. Zou K, Ren J, Luo S, et al. Intrauterine hyperglycemia impairs memory across two generations. Transl Psychiatry. 2021;11(1):434. Published 2021 Aug 20. doi:10.1038/s41398-021-01565-7
3. Haghir H, Hami J, Lotfi N, Peyvandi M, Ghasemi S, Hosseini M. Expression of apoptosis-regulatory genes in the hippocampus of rat neonates born to mothers with diabetes. Metab Brain Dis. 2017;32(2):617-628. doi:10.1007/s11011-017-9950-2
4. Hami J, Sadr-Nabavi A, Sankian M, Balali-Mood M, Haghir H. The effects of maternal diabetes on expression of insulin-like growth factor-1 and insulin receptors in male developing rat hippocampus. Brain Struct Funct. 2013;218(1):73-84. doi:10.1007/s00429-011-0377-y
5. Hami J, Vafaei-Nezhad S, Ivar G, et al. Altered expression and localization of synaptophysin in developing cerebellar cortex of neonatal rats due to maternal diabetes mellitus. Metab Brain Dis. 2016;31(6):1369-1380. doi:10.1007/s11011-016-9864-4
6. Ding GL, Wang FF, Shu J, et al. Transgenerational glucose intolerance with Igf2/H19 epigenetic alterations in mouse islet induced by intrauterine hyperglycemia. Diabetes. 2012;61(5):1133-1142. doi:10.2337/db11-1314
责任编辑|代丝雨
