Cell最新：人类病理性Tau蛋白的翻译后修饰图谱，进一步细分阿尔兹海默症临床阶段|Cell|病理性|蛋白

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　　阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease, AD）是众所周知的严重威胁患者生存质量的神经退行性疾病，其病理特征主要为β-淀粉样蛋白（Aβ）的淀粉样斑块（plaques）和微管结合蛋白Tau形成的神经纤维缠结（neurofilament tangle, NFT）。尽管多项研究已证实Aβ的重要性，但截至目前，针对Aβ治疗策略的研究已陷入僵局。因此，越来越多的研究人员把目光集中在Tau。在AD疾病发展过程中，病理性神经元纤维Tau聚集体显示出朊病毒样特征，即起始聚集的“种子”Tau（seeding）可以在相邻神经元间传播【1,2】。先前有报道指出，当存在高分子量的寡聚过度磷酸化的Tau（AT8和AT100）时，脑裂解液中的Tau会发生聚集【3】。当然，除磷酸化外，也有相当一部分研究提出Tau还受到其他多种蛋白翻译后修饰（post-translational modifications, PTM），从而影响NFT的形成。

　　免疫组化一直是鉴定和定量Tau蛋白形式的主力军，尽管此类基于抗体的方法易于实施并能够提供半定量信息，但终究无法准确地检测定量变化或确定PTM化学计量。考虑到PTM可以显著改变蛋白质的功能和毒性，剖析人类AD中病理性Tau的特定分子特征对于早期诊断和机制指导疗法的发展至关重要。

　　2020年11月13日，来自哈佛医学院的Judith A. Steen课题组在Cell杂志上发表了题为“Tau PTM Profiles Identify Patient Heterogeneity and Stages of Alzheimer’s Disease”的文章，在这项研究中，作者利用先前开发的一种靶向的高通量定量质谱的方法—FLEXITau（full-length expressed stable isotope-labeled Tau），对91例人体组织（尸检）进行了定量和定性的蛋白质谱分析，表征和绘制了AD中病理性Tau的PTM图谱，并确定与tau蛋白的“seeding”潜能相关的PTM最小集合及其在NFT形成过程中的作用。这些定性和定量数据阐述了tau蛋白的相关PTM在疾病进展中的关键作用，并为治疗性抗体，成像试剂和AD诊断的关键靶标的开发提供了关键的靶点。

　　首先，作者对来自49例AD患者和42例对照的顶叶缔合皮层（BA39）灰质中可溶于/不溶于十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl）的Tau进行绝对定量分析。结果发现，与对照组相比，AD患者的可溶性Tau总量较低且不溶性Tau（构成NFT的主要tau成分）高约100倍。在可溶和不溶性级分中0N，1N，2N，3R和4R Tau异构体特异性肽的相对量也在两组间显示出明显差异，且0N和4R亚型在AD患者中更易于聚集（见下图1）。重要的是，在所有样品的88个氨基酸残基上作者共鉴定出95个不同的PTM，并分析出它们所在患者中的频率，这是了解不同PTM病理和人群异质性的关键。

　　图1，工作流程示意图及Tau的亚型分布和PTM分子表征

　　接下来，作者对两个队列中鉴定的Tau PTM进行无监督分层聚类分析并使用PLS-DA方法来确认究竟哪些可量化的PTM在AD和对照组的区分更为重要。作者在AD患者所在的分别对应临床Braak分期的V和VI阶段的聚类b和c中，观察到一些较高频率的PTM特定组合，且在两个聚类中多为相似，这一结果在很大程度上反映了PTM与AD疾病进展的相关性，鉴于疾不同阶段的PTM谱存在明显差异，提示早期干预和晚期治疗AD可能需要不同的靶点药物。

　　值得注意的是，在两个队列中，富含脯氨酸的区域（Proline rich region, PRR）和C端肽以及微管结合域（microtubule binding domain, MBD）未修饰肽的丰度呈负相关关系，PRR和C端肽磷酸化程度的增加可能涉及中和MBD结构域中的正电荷从而促进聚集事件的发生。此外，作者发现未修饰的C端肽在AD中的丰度低，且存在一个对照簇中C端肽完全未修饰，提示C端肽的修饰可能是衰老和AD病理过程中的早期事件。

　　有趣的是，来自AD和对照组的十二烷基肌氨酸钠溶液不可溶的Tau，在纤维化过程中存在持续性且有秩序的PTM发生顺序。为了进一步地识别与Tau蛋白“seeding”活动相关的PTM，作者根据分子量及“seeding”能力的不同，讲tau蛋白归于以下四类，包括（1）十二烷基肌氨酸钠可溶性Tau（以下简称为S-Tau，不可溶的简称为I-Tau）；（2）通过MC1抗体免疫亲和柱分离的可溶性Tau（以下简称为MC1-Tau）；（3）可溶性低分子量Tau（LMW, 50 kDa）；（4）寡聚高分子量Tau（HMW, > 120 kDa），并将这四种Tau级分数据与不溶性Tau数据进行比较。结果显示，在具有“播种”能力的HMW和I-Tau以及不具备“播种”能力的LMW和S-Tau之间的PTM图谱有所不同，泛素化修饰似乎对于具有“播种”能力的Tau而言是独有的。此外，结果表明随着Tau颗粒度从LMW至HMW和MC1-Tau逐渐增长至十二烷基肌氨酸钠溶液不可溶的纤维化Tau，PTM也逐渐发生累积，这些数据与“seeding”能力研究结果一起提供了形成tau蛋白寡聚体所需的最小PTM集合。

　　最后，作者根据病理性Tau的定性及MS定量数据中观察到的最显著特征，提出Tau纤维化形成的可能模型。随着疾病的进展，不同阶段所观察到的PTM数量和位点的占有率逐渐增加，例如上述提到的簇a中临床Braak阶段最低仅为0–I，仅显示Tau的磷酸化且PRR结构域占据三个位点；在簇d中，受试者的临床Braak阶段为III-IV，在PRR结构域额外增加六个磷酸化位点和C端一个磷酸化位点；而在对应临床Braak阶段为V或VI的簇b中，MBD结构域多个位置出现乙酰化和泛素化修饰；在对应临床Braak阶段为VI的簇c中，PTM从N端到C端整体呈增加趋势。总体而言，这些分析表明Tau 0N和4R亚型易于发生聚集，PTM逐步级联，包括C端裂解和PRR带负电的磷酸化，随即在MBD上发生的乙酰化和泛素化修饰完成电荷中和，是Tau纤维化形成和AD疾病进展的关键步骤。