导读：

　　发育性和癫痫性脑病(DEEs)是发生于婴儿期的严重神经系统疾病，与癫痫和智力残疾有关(ID)。遗传因素起主要作用，近年来，在DEE 患者中发现了编码γ-氨基丁酸a型(GABAA)受体亚基的基因中的大量遗传变异体，这些变异被认为引起功能丧失受体，导致神经元gaba抑制能活性降低，最终使大脑回路过度兴奋，从而引起癫痫。常用的抗癫痫药物（ASM）可增加GABA活性，从而用于治疗癫痫，但是增加GABA活性的GABRB3变异体患者有更严重的发育和癫痫性脑病。近期，《nature communications》期刊上发表了题为“Gain-of-function and loss-of-function GABRB3 variants lead to distinct clinical phenotypes in patients with developmental and epileptic encephalopathies”的文章，作者发现研究中大约一半的致病性GABRB3错义变异体增强GABA能活性（功能获得），而其余一半是功能丧失的变异。各组的患者表现出不同的临床表型。这两种类型的分子表型与两种不同的临床人群密切相关，这两种人群在发作年龄、发作类型、智力损伤和治疗反应方面存在差异。因此可得出GABRB3介导的DEE基本上包括两组不同的患者，即功能增益患者和功能丧失变体患者，这一发现解释了GABAA受体错义突变如何导致如此多样化的临床表现。

　　GABRB3 错义变异体的功能评估

　　作者团队发现在GABRB3的编码区域内发现了54种与癫痫相关的错义变体（图 1a，b）。此外，还发现了另外九个截断、帧移位或删除变体散布在β3亚基多肽上（图 1c）.作者从电生理分析中确定了大小大致相等的致病变异的两个不同的功能群：一种是GABA敏感性增加而最大GABA振幅无显著降低的新型GOF变体；另一种是GABA敏感性降低伴或不伴最大GABA振幅降低的LOF变体。受体对GABA的敏感性是GABAA受体的关键基本特性。将错义变体的受体对GABA（GABA EC50值）的敏感性，并与野生型受体进行了比较（图 2b，c）。GABA EC50的减少推断受体对GABA更敏感，具功能增益（GOF）特征。GABA EC50的增加表示受体对GABA不那么敏感，具备功能丧失（LOF）特征。其余10种变体没有显著改变GABA的灵敏度，GABA EC50值没有显著变化就证明了这一点。值得注意的是，相同氨基酸残基的不同变体可导致相反的功能结果。Thr281残基中的两个变体就是例证，其中p.（Thr281Ala）变异引起GOF和p.(Thr281Ile）引起LOF。总体而言：在p.和p.变体的情况下，虽然报告了GABA敏感性的增加，但降低的电流振幅水平被解释为主要参数，以断定变体是LOF。总之，我们证明GABRB3变体可以导致GOF以及LOF受体，而且患者的临床表型与功能结果密切相关。因此，不同的功能结果解释了单一病因如何导致广泛的临床表型以及为什么一些患者难治疗的难题。)细胞中GABAA受体的另一个重要特性是流经通道的电流量，这是由GABA激活的最大电流振幅衡量的。最大GABA电流振幅的减少可以推断出受体对细胞表面的黏附作用减少或GABA对受体的门控能力降低（事实上的单倍体功能不足），因此可能揭示出进一步的LOF变异。在评估的54个变异中，10个GABA敏感性不变的变异在最大电流振幅上也没有显著变化，这表明这些变异没有明确的LOF或GOF性状（图 3）。在观察到的20种GOFGABA敏感性中，只有3种变异显示最大GABA激活电流振幅显著降低，然而，这三种变异也导致自发受体活动(没有GABA的电流)，导致低估当前测量的结果(补充图 S3)。最后，在GABA敏感性为LOF的24个变异中，有10个也显示出最大电流振幅的显著降低(p

图1. 

　　GABRB3 癫痫相关突变体

图2.

　　GABRB3 错义变异体的功能评估

图3.

　　GABRB3 错义变体的GABA灵敏度和最大电流的变化

　　临床表型的不同范围与GABAA受体的功能变化关系

　　GOF患者客观上具有更严重的结局：首次癫痫发作年龄比LOF患者早（通常为1-3个月），常见癫痫发作类型为局灶性癫痫发作（图 4b），EEG表现为EEG背景活动重度紊乱，快速活动和多灶性癫痫样异常混合（图 5），重度智力残疾(ID)的患病率更高（图 4c），行为异常无显著差异，肌张力减退和小儿麻痹症和难治性癫痫在GOF队列中的患病率显著更高，不太可能对ASM有反应。总体而言，这些患者类似于其他遗传DEE的表型，如GOF SCN2A和SCN8A，其中癫痫发作也在生命的头六个月内，认知结果不佳，局灶性癫痫发作很常见。此外，最近在早期发作灾难性DEEs的患者中描述了SCN1A中的GOF变体。与GOF KCNH1变体也有一些表型重叠。GOF变体患者几乎普遍呈现新发变体，这一特征可能与临床表型的严重性有关。GOF变体患者DEE的严重性也可以解释为什么对GABAA受体变体的早期家族研究只发现了LOF变体，而更强大的下一代测序已经发现了大量新GOF变体。相反，LOF变异患者一般表现为较轻的表型如热性惊厥，随后是不同类型的全身性癫痫发作，主要为肌阵挛性或失张力性发作。Thr281残基中的两个变体很好地说明了使用功能结果作为临床表型的预测因子的有效性，如上所述。GOF患者p.（Thr281Ala）变异在小于一个月大时癫痫发作，严重智力残疾且治疗无效。相反，LOF p患者（Thr281Ile）变异在7个月时癫痫发作，中度智力残疾并对戊巴比妥、司替戊醇和丙戊酸盐多药治疗有反应（对GABA能药物的积极反应突出了LOF GABRB3变体与LOF SCN1A变体的相似性，并且SCN1A变体患者禁忌的治疗，如卡马西平，也可能加剧LOF GABRB3患者的癫痫发作。因此，不同的功能结局为单一、单基因疾病原因如何导致广泛的临床表型以及为什么一些患者对治疗难治的难题提供了解释。

图4. 拥有LOF或GOF GABRB3变体的患者的临床特征

图5. 来自含有GOF或LOF变体的患者的代表性脑电图

　　不导致GABAA受体功能变化的突变

　　GnomAD数据库中描述的致病和良性变异被映射到β3亚基的2D结构上。92个残基的良性变异高度集中在蛋白质序列中对基本受体功能不那么重要的位置，包括信号肽、初始α螺旋、β片和无序环，如大M3-M4细胞内区域（图 6）。对于没有观察到明显功能变化的10个变体，有5个是遗传性的，这五个没有导致GABAA受体功能变化并被归类为良性的遗传变体位于富含gnomAD数据库变体的区域（图 6a）。这包括p.（Gly32Arg）和p.（Val37Gly）在最初的α-螺旋中，p.（Arg142Leu）在无序的细胞外环中，和p.（Glu357Lys）和p.（Arg429Gln）在细胞内M3-M4环中。其中2例患者携带的遗传的变体p.（Glu357Lys）和p.（Arg429Gln），这些变体在gnomAD数据库中出现了多次，因此可归类为良性(BS2、BS3)。另外3例患者包含遗传性p（Gly32Arg），p.（Val37Gly）和p.（Arg142Leu）变体具有完全外显率，家族中携带者未受影响，并且也可以被归类为良性(BS3、BS4)。关于Arg142变体，这个位置的另一个变体 p.（Arg142His）存在于gnomAD数据库，这是将p.(Arg142Leu）变异归类于良性的充分证据。一般来说，这些患者的表型是轻度到中度重度，类似于LOF患者，因此，在没有功能效应的变体中，五个遗传的变体都可以归类为良性或可能良性，并可能被视为种群变体。其余5个新发变体，其中，p.（Pro253Leu）变体是唯一检测的变体，表现出脱敏动力学显著增加（这可能构成事实上的LOF特征，对于其余4个变体将新发状态与功能分析的结合意味着这些应归类为未知临床意义(VUS)状态的变体：两个VUS变体的位置，p.（Ser420Ile）和p.（Ser433Leu），在GABAA受体亚基之间不保守的氨基酸和细胞内M3-M4环形区域表明，这些也可能是良性的。其余两个VUS变体，p.（Gln210His）和p.（Leu310Ile），位于受体功能非常重要的区域和GABAA受体亚基中高度守恒的氨基酸位置。因此，这两种变体可能会影响测试参数以外的其他参数的受体功能。相比之下致病性GOF和LOF变体绝大多数位于已知对GABA介导的受体激活的变构转导至关重要的区域，包括GABA结合位点、连接细胞外和跨膜结构域的耦合环，以及孔隙衬里M2跨膜区域以及M1，并在较小程度上M3区域（图 6b）。GABA结合位点位于细胞外结构域的β3-α1亚基界面（图 1b）。GABA分子内在结合步骤中直接与GABA相互作用的所有残基都是LOF，并显著降低GABA灵敏度（图 7a）。这些残留物高度保守，并与GABA发生密切的相互作用，对这些残留物的改变会导致LOF。相比之下，GOF和LOF变体都存在于GABA结合位点周围的残留物中（图 7b）。周围的残留物具有重要的功能，例如支持绑定口袋的结构完整性，并启动激活路径的第一步。因此，观察到这些残留物的变异可能导致GOF和LOF，这表明其中一种或另一个功能受到影响。当受体将GABA结合到离子通道孔的信号并激活通道时，细胞外和跨膜结构域界面的耦合回路会改变构象。特别是，细胞外结构域β1-2环和跨膜结构域M2-M3环在受体激活期间经历了大规模的结构重排。这些耦合环路的变体是GOF和LOF的混合物，这可能是因为它们可以稳定或破坏这些回路之间的相互作用和必要的构象变化（图 7c,d）。最后，M2跨膜区域排列在通道孔隙，在稳定受体开放和闭状态以及与通过的离子相互作用方面都至关重要。除了确定了GOF和LOF变体的Thr281残留物外，M2区域内的变体统一为GOF（图 7e）。在一些情况下，我们得出结论，变体具有GOF特征或良性，而之前的分析表明LOF特征。在p.（的情况下Leu170Arg）和p.（Ala305Val）变体，虽然报告GABA灵敏度增加，但降低的电流振幅水平被解释为得出变体LOF的主要参数。因此，绝大多数致病性GABRB3变体都显著影响了GABA敏感性参数。

图6. 致病性和良性错

　　义突变体GABRB3变体的二维结构图

图7. 3D结构图和浓度-响应曲线

　　基于临床指标预测LOF和GOF GABRB3变体

　　确定GABRB3错义变异时，有几个临床特征可以帮助预测变异是LOF还是GOF。LOF变异的关键特征包括发病年龄为6个月或以上，并存在热性惊厥。支持特征包括缺乏肌张力减退和小头畸形。随着患者的发展，全身性发作（包括失张力性、肌阵挛性和双侧张力-阵挛性发作）的典型LOF变体、EEG伴全身性发作间期癫痫样不协调(IED)和ID在正常或轻度至中度范围内。对于GOF变体，关键特征是发病年龄小于6个月时出现的局灶性癫痫发作，支持特征包括肌张力减退和小儿麻痹症。随着患者年龄的增长，GOF变异表现为局灶性发作、EEG伴多灶性发作间期痫样放电和重度ID。如果患者表现具有这些适应症的混合物，则需要对变体进行功能测试，以确定其是否具有LOF或GOF特征。纳入了比较LOF和GOF变异患者临床指标的p值。为了促进个体患者更好的预后，当诊断出患有新的GABRB3变异的患者时，应建立功能类别。不幸的是，在许多情况下，可能不可能获得功能分析。由于患者的表型似乎与变异的功能结果紧密相关，临床指标可以用于以合理的可靠性预测功能类别。最初，发病年龄和存在局灶性或发热性癫痫发作的关键特征区分了LOF或GOF变异的患者，而张力减退和/或小头畸形的存在支持GOF变异。随着患者年龄的增长，广泛性癫痫发作类型、脑电图特征和智力残疾的严重程度成为该变异是否导致GOF或LOF的额外预测因素。这些信息可以总结为一个流程图，可以帮助临床医生预测GABRB3变体是否具有GOF或LOF特征（图 8）。

图8. 基于临床指标预测LOF和GOF

　　GABRB3变体的流程图

　　小结

　　作者证明GABRB3变体可以导致GOF和LOF，患者的临床表型与功能结果密切相关。鉴于各种GABAA受体亚基之间的高度序列相似性和功能重叠，须确定大多数GABR基因是否存在类似的情景，其中GOF变异可能是一种常见的现象。团队的数据提示着癫痫中对GABA能系统的理解发生了概念上的转变，认识到在GABA能活性增加的患者中发现了更严重的癫痫综合征。因此，在兴奋/抑制失衡中，GABAA受体活性的经典观点不适合理解癫痫发生。由于之前的研究主要集中在降低GABA能活性的遗传变异如何导致癫痫疾病，现在最重要的是团队开始研究GABA能活性的增加如何导致严重的遗传性癫痫。其中可能包括GABAA受体的负变构调节剂，这些研究还可以指导未来的药物研发和新治疗方案。

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　　Absalom NL, Liao VWY, Johannesen KMH, Gardella E, Jacobs J, Lesca G, Gokce-Samar Z, Arzimanoglou A, Zeidler S, Striano P, Meyer P, Benkel-Herrenbrueck I, Mero IL, Rummel J, Chebib M, Møller RS, Ahring PK. Gain-of-function and loss-of-function GABRB3 variants lead to distinct clinical phenotypes in patients with developmental and epileptic encephalopathies. Nat Commun. 2022 Apr 5;13(1):1822.