阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD）是老年人最常见的神经退行性疾病。“淀粉样蛋白级联假说”（Amyloid cascade hypothesis）理论在AD发病机制研究中占有重要地位30余年，该理论认为脑内神经元胞外β淀粉样蛋白（Amyloid β，Aβ）病理性沉积是AD的始发因素，可诱发神经元胞内Tau蛋白磷酸化并形成神经原纤维缠结（Intracellular neurofibrillary tangles, NFTs），最终导致神经元死亡及认知障碍。因此，基于Aβ清除的免疫疗法是当前AD转化治疗研究的热点(1)。目前已有两种anti-Aβ单克隆抗体获得美国FDA批准，证实其可有效清除病理性Aβ沉积，减缓早期AD患者的病程进展。然而，anti-Aβ单克隆抗体（如仑卡奈单抗）对大脑微血管的副作用也不容小觑，临床表现为抗体治疗诱发的淀粉样蛋白相关成像异常，包括血管源性水肿、出血等(2)。因此，寻求Aβ之外的药物靶点显得尤为重要。
近年来，小胶质细胞成为AD研究的最大热点之一。小胶质细胞是AD病理的始动应答者，在Aβ斑块周边富集的活化型小胶质细胞具有保护作用(3)。美国圣路易斯华盛顿大学Colonna教授团队前期研究证实激活型受体TREM2在介导疾病相关小胶质细胞（Disease-associated microglia, DAM）形成及促进病理性Aβ清除中起关键作用(4-6)。当前，TREM2激活型单克隆抗体 AL002c已经进入AD临床2期试验，并取得了理想疗效(7)。值得关注的是，小胶质细胞对AD的病理反应受到激活型和抑制型受体的双重调控。免疫抑制型受体功能增强型突变可增加AD患病风险(8)。因此，使用拮抗型单克隆抗体靶向小胶质细胞免疫抑制型受体，有望成为增强小胶质细胞活性的新途径，甚至还可与激活激动型受体的单克隆抗体联合应用，产生协同作用，增进Aβ清除效果。
对此，2024年4月3日，美国圣路易斯华盛顿大学Colonna教授团队侯金超博士及博士生陈昀以共同第一作者于Science Translational Medicine在线发表题为“Antibody-mediated targeting of human microglial leukocyte Ig-like receptor B4 attenuates amyloid-dependent pathology in a mouse model”的研究论文。他们报道了AD患者脑内Aβ沉积斑块周边的小胶质细胞特异性高表达白细胞Ig样受体B4（Leukocyte Ig-like receptor B4，LILRB4），其表达水平与小胶质细胞活化标志物ApoE及脑组织病理性磷酸化Tau蛋白水平成正相关。
该团队设计、构建了Fc区域LALA-PG突变型抗人LILRB4单克隆抗体（anti-LILRB4 mAb），该修饰可有效避免抗体Fc区域介导的细胞毒性副作用，并证实Fc突变型anti-LILRB4 mAb对人LILRB4蛋白具有高度亲和力、可特异性阻断LILRB4通路活化。研究者通过合成Zirconium-89（89Zr）标记anti-LILRB4（89Zr-anti-LILRB4）及89Zr标记对照抗体（89Zr-Ctrl IgG2a），联合小鼠活体PET/CT成像，在体证实89Zr-anti-LILRB4可有效在表达人LILRB4及相关染色体调控区域的AD小鼠模型（ILT-Telo Tg x 5XFAD）的脑组织中滞留。
通过免疫荧光及流式细胞术检测，研究人员发现ILT-Telo Tg x 5XFAD模型脑内富含ApoE的Aβ沉积斑块附近活化的小胶质细胞人LILRB4表达特异性上调，表明该模型可模拟临床AD患者LILRB4的表达特征。同时较5XFAD模型相比，ILT-Telo Tg x 5XFAD模型显示小胶质细胞对病理性Aβ反应性降低，表现为Aβ斑块附近 PU.1+小胶质细胞数量及IBA1+表达显著下降，提示ApoE-LILRB4抑制性通路可能介导小胶质细胞行为改变。在ILT-Telo Tg x 5XFAD模型4个月年龄段长期给与Fc突变型anti-LILRB4或对照抗体（Ctrl IgG2a）可有效增强小胶质细胞活性(如CLEC7A表达增加)，改变小胶质细胞转录特征，增加小胶质细胞吞噬Aβ斑块的能力，从而延缓不同脑区Aβ病理性沉积，降低Aβ导致的神经突触营养不良等。
图1：长期给予Fc突变型anti-LILRB4可有效增强小胶质细胞对病理性Aβ反应性，表现为大脑皮质区（Cortex）、海马区（Hippo.）及杏仁核区（Amy.）病理性Aβ斑块周边小胶质细胞活化标志物CLEC7A表达升高（A，B），及大脑皮质区（1：cortex）、海马区（2：hippo）及杏仁核区（3：Amy.）病理性Aβ水平（6E10）下降（C，D）。
文章的最后，研究人员利用计算机模拟，找到了人LILRB4 和ApoE的潜在结合位点，再通过表达、纯化突变型LILRB4蛋白和体外结合实验等，证明了anti-LILRB4 mAb通过竞争性结合LILRB4胞外区域两个Ig样结构域之间的D1-D2区域，阻断ApoE与LILRB4结合，从而抑制LILRB4介导的免疫抑制性信号，揭示了anti-LILRB4阻断LILRB4-ApoE通路的作用位点。
图2：小鼠ApoE与人LILRB4的结合位点预测及LILRB4突变设计。(A) 左侧：表面和结构模型显示体外对接建模预测的小鼠ApoE（mAPOE，黄色）与人LILRB4（hLILRB4，青色）结合的前10个模型。右侧：所有mAPOE的结合位点均指向LILRB4胞外区域两个Ig样结构域之间的D1-D2区域，该区域含有特定的环形结构氨基酸序列K157ERAAHP163（黑色虚线椭圆标记）。(B)表面和结构模型显示mAPOE（黄色）与hLILRB4（青色）结合的关键氨基酸位点。关键氨基酸T30、P35和环形结构如图标记所示。黑色虚线椭圆突出显示了该预测复合物中mApoE和hLILRB4之间的结合界面。(C) 结构模型显示不同关键氨基酸T30、P35、Y121和环形结构的位置关系。(D) 结构模型显示环形结构氨基酸序列无功能性突变替换，其中整个序列K157ERAAHP163被替换为V157GGVGGP163。
综上，该工作首次证明了小胶质细胞抑制型受体作为AD药物靶点的可能性，为靶向人小胶质细胞活性调控及病理性Aβ清除提供了新的转化路径。同时，基于小胶质细胞活性调控的免疫疗法还可扩大到其他神经退行性疾病甚至是巨噬细胞相关的外周免疫性疾病的应用。相关美国发明专利正在审批中。该工作得到美国圣路易斯华盛顿大学Dr. David Holzman（Hope Center of Neurological Disorder），Dr. YongJian Liu（Department of Radiology）及Mayo Clinic等的支持。
招聘信息
侯金超博士目前以浙江大学临床“百人计划”研究员身份任职于浙江大学医学院附属儿童医院及国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，主要从事神经免疫、脓毒症致多脏器功能损伤相关研究，涉及抗体改造优化、利用snRNA-seq等技术解析中枢及外周免疫性疾病多细胞转录组图谱和细胞间相互作用调控网络等工作。诚招具有医学、生物学、计算机生物学背景的博士后及科研助理，也欢迎医学专业考生报考研究生（联系方式: jinchao_hou@zju.edu.cn）。
参考文献
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