小胶质细胞通过触发髓样细胞2 (TREM2)上表达的受体吞噬营养不良的神经元，在突触消除中发挥关键作用。它们还参与阿尔茨海默病(AD)中β -淀粉样蛋白(Aβ)斑块的清除;尽管如此，trem2介导的β -淀粉样蛋白(Aβ)斑块吞噬背后的驱动力仍然未知。

　　近期，advanced science期刊上发表了题为“Microglia Gravitate toward Amyloid Plaques Surrounded by Externalized Phosphatidylserine via TREM2”的论文，作者团队利用先进的2D/3D/4D共培养系统，在TREM2(外显子2中的一种移码突变)脑类器官/小胶质细胞/组装体中发生功能缺失突变，发现aβ斑块周围营养不良的神经元产生的外化磷脂酰丝氨酸(ePtdSer)会加速通过TREM2清除aβ。此外，还研究了散发性(基于crispr-cas9的APOE4系)和家族性(APPNL-G-F/MAPT双敲小鼠)AD模型中的小胶质细胞是否对eptdser阳性Aβ斑块表现出TREM2水平降低和缺乏吞噬活性。在AD进展过程中ePtdSer存在的背景下，trem2依赖性Aβ斑块的小胶质细胞吞噬提供了新的见解。

　　结果1. 实验设计

　　为了证明神经元和小胶质细胞之间的生理相互作用，以ipsc衍生的神经元(iNeurons)、ipsc衍生的小胶质细胞(iMG)和ipsc衍生的脑类器官(ico)的不同组合建立了2D/3D共培养系统(图1a)。在这些不同的培养方法的同时，还使用了AD小鼠模型(APPNL-G-F/MAPT dKI小鼠)。为了可视化和量化，我们使用了3D活细胞成像(长时差2D成像)、4D活细胞成像(短时差3D共聚焦成像)和3D表面渲染技术等多种成像技术。例如，使用二维共培养模型捕获ePtdSer(使用PSVue染料染色)，游动和吞噬iMG以及神经元与iMG之间的相互作用(图1b)。用萤光YG微球验证了小胶质细胞的吞噬活性和吞噬小胶质细胞被捕获，并使用长期延时2D成像(视频S1，支持信息)进行可视化。对于先进的3D疾病模型，ipsc衍生的脑组装体(3D混合培养模型，包括ico和iMG)通过免疫组织化学(IHC)开发和验证(图1c)，并使用单细胞RNA测序(scRNAseq)进行表征(图1d)。

　　小胶质细胞群存在于脑集合体以及神经元、早熟神经元、星形胶质细胞、过早星形胶质细胞、少突胶质前体细胞(OPCs)和增殖/放射状胶质细胞内(图1d)。使用相应的基因(例如，神经元的MAP2，星形胶质细胞和胶质细胞的GFAP，小胶质细胞的TREM2或LPL, OPCs的CSPG4等)进一步验证脑组装体的组成细胞(图1c,d)。共培养系统的详细方法和验证见方法和图S1-S4。此外，我们比较了iMG、2D共培养iMG和3D共培养iMG中的小胶质细胞特异性基因(图S5)。正如我们所料，与仅img或2D共培养模型相比，3D小胶质细胞基因的表达相对较高。

图1.本研究中使用的实验模型(2D/3D/4D共培养）

　　结果2.磷脂酰丝氨酸(PtdSer)促进小胶质细胞对Aβ的吞噬

　　由于众所周知，小胶质细胞同时吞噬ePtdSer+突触和Aβs，[4a,b,13]我们认为应该研究PtdSer和Aβa之间的关系。有趣的是，当PtdSer也被处理时，iMG对phrodo标记的寡聚物A/n (pHrodo-oA/n)的吞噬性能明显优于单独处理pHrodo-oA/n(图2a,b，视频S2，支持信息)。为了研究PtdSer如何加速oA - 0的摄取，我们用PtdSer特异性染料(PSVue)、pHrodo-oA-0和PtdSer孵育小胶质细胞。长期延时成像显示PSVue信号增加，提示pHrodo-oA-1/4被主动摄取(图2c，视频S3，支持信息)。这些发现表明，PtdSer识别可以触发小胶质细胞摄取oA-1。为了获得更深入的可视化和更好的生理条件，神经元与iMG共培养(图2d-f)。正如预期的那样，在神经元死亡时检测到大量ePtdSer+信号(图2e)。有趣的是，大量的信号与pHrodo-oA共定位，表明ePtdSer+-Aβs(白色箭头;图2 e)。4D活细胞成像和IMARIS渲染系统显示ePtdSer+Aβs被iMG吞噬(图2f，视频S4，支持信息)。综上所述，这些结果证实了PtdSer可能调控小胶质细胞a - 1 / 4的吞噬作用。接下来，我们研究TREM2是否介导ePtdSer+-A的吞噬βs。

图2.PtdSer改善了小胶质细胞对Aβ。

　　结果3. TREM2介导小胶质细胞吞噬ePtdSer+-Aβ

　　为了研究TREM2是否介导ePtdSer+-Aβs的吞噬，我们对APPNL-G-F/MAPT dKI小鼠进行了iMG迁移实验、2D共培养(神经元+iMG)、3D脑组装体(3D脑类器官与iMG)和大脑进行了冷冻切片和可视化(图3)。首先，我们使用趋化芯片进行了iMG迁移实验(图3a)。

　　在中心腔中加入添加了PtdSer (1 μg mL−1)、pHrodo-oligomeric A / n (pHrodo-oA/n) (2 μM)或PtdSer+ pHrodo-oA/n的培养基后，比较了不同条件下招募的img数量、吞噬的pHrodo-oAβs和TREM2强度。有趣的是，与对照组、PtdSer组或pHrodo-oA组相比，PtdSer+ pHrodo-oA组招募的iMG数量显著增加(图3b)。我们还验证了PtdSer可以增加iMG的吞噬能力(图3c)，并证实在相同条件下TREM2水平显著升高(图3d)。这意味着PtdSer可以成为iMG向β -淀粉样肽的吸引物。此外，在2D共培养模型中，iMG聚集成ptdser富集区，TREM2表达水平较高(白框;图3 e)。三维渲染成像显示放大的ePtdSer+-Aβs和周围的TREM2+ Iba1信号束(白色圆圈;图3 e)。我们还捕获了一个吞噬小胶质臂，在脑组装体(白色框;图3 f)。值得注意的是，小胶质臂的前缘显示TREM2的部分增加，表明小胶质细胞通过TREM2感知ePtdSer+-Aβs(白色圆圈;图3 f)。我们还通过western blot分析证实了PtdSer治疗后TREM2水平的显著增加(图S6a)。遗憾的是，我们无法通过大量RNA测序得到TREM2水平的显著差异(P > 0.05)。然而，我们可以通过STRING蛋白-蛋白相互作用(PPI)数据库(https://string-db.org/)确认Top deg (MMP1, IGFBP3, IGF2R, IL1A)与TREM2相互作用(图S6b-g)。

图3.小胶质细胞通过TREM2向ePtdSer+A𝛽s吸引。

　　接下来，由于有必要检查AD小鼠模型中ePtdSer+-Aβs的存在数量及其与TREM2+小胶质细胞的相关性，我们对APPNL-G-F/MAPT dKI小鼠的脑皮质组织进行冷冻切片并可视化(图4;图S7)。尽管使用了不同的AD小鼠模型，但如Huang等人先前报道的，大部分a-1/4斑块被ePtdSer包围(图4a;图S7a)。[7]与共培养和3D脑组装体模型一致，在PtdSer富集区聚集的小胶质细胞数量越多(PtdSer > 5)， TREM2的表达水平显著提高(下两个白色圆圈;图4 a)，尽管A -时延斑块的大小没有显著差异(量化数据;图4 b)。此外，PSVue信号强度与TREM2表达水平和小胶质细胞(Iba1)计数显著相关(图4b)。值得注意的是，小胶质细胞并没有聚集在ptdser较差的A / n斑块中(图4a上两个白色圆圈;图S7b)。因此，我们认为TREM2可能介导ePtdSer+A的小胶质细胞吞噬Aβs。

图4.在APPNL-G-F/MAPT dKI小鼠中，PtdSer+富区和贫区之间的小胶质细胞对A𝛽斑块反应的差异。

　　结果4.TREM2的功能丧失导致小胶质细胞摄取ePtdSer+-Aβ的缺陷

　　为了验证TREM2的缺失是否会导致ePtdSer+-Aβs小胶质细胞吞噬缺陷，TREM2突变体iMG(通过两个等位基因TREM2外显子2的移码突变丧失功能;纯合子的;使用P59AfsTer16和P59AfsTer46)和等基因正常对照iMG (图5)。与正常等基因iMG吞噬ePtdSer+-Aβs相比，TREM2突变体iMG对ePtdSer+-Aβs的吞噬活性不足(图5b;白色箭头)。然而，未观察到与激活状态相关的小胶质细胞形态学差异(图5b)，这表明参与小胶质细胞激活的其他基因可能作为维持其状态的补偿性备份(例如LPL、CD33、CX3CR1等;图S8)。此外，为了确定ePtdSer+-A的小胶质摄取不足是否为trem2依赖性行为，3D长期延时成像进行ing(图5c)。有趣的是，正常TREM2等基因iMG在PtdSer治疗后对aβs的吞噬能力显著增加，而TREM2突变体iMG则没有(图5c)，这表明小胶质细胞对ePtdSer+-A的摄取取决于TREM2的功能。最后，3D渲染跟踪的4D活细胞成像证实，TREM2突变体iMG对ePtdSer+-Aβs的吞噬活性较低，通过Aβs而未被吞噬(图5d，视频S6)，而正常TREM2等基因iMG对ePtdSer+-Aβs的吞噬活性较低(图5d，视频S5)。我们的假设是小胶质细胞通过TREM2向ePtdSer+-Aβs倾斜。

图5.TREM2功能的丧失导致ePtdSer+-A𝛽识别和吞噬活性的缺陷。

　　结果5.AD疾病模型显示TREM2水平降低，ePtdSer+-Aβs的吞噬活性缺乏

　　由于许多研究表明AD中TREM2表达的功能丧失或降低，散发性(crispr - cas9为基础的APOE4系;用ipsc来源的星形胶质细胞(图6a)和家族性(APPNL-G-F/MAPT dKI小鼠)AD模型验证trem2依赖性小胶质细胞吞噬缺陷。正如预期的那样，APOE4 iMG中的小胶质TREM2蛋白和mRNA水平下降，而与小胶质功能相关的其他蛋白或mRNA水平未见变化(图6a;图S8，支持信息)。与PtdSer处理的APOE3 iMG的吞噬活性增加相反(图2a,b，视频S2，支持信息)，APOE4 iMG在PtdSer处理后没有显示出增加的吞噬活性(图6b，视频S7，支持信息)。我们使用3D渲染跟踪的4D活细胞成像也显示APOE4 iMG对ePtdSer+-A - 1缺乏吞噬活性(图6c，视频S8，支持信息)。这些结果表明，APOE4 iMG的吞噬不能通过PtdSer治疗来调节，可能是由于缺乏功能性TREM2。接下来，为了在先进的3D共培养系统中比较APOE3 iMG和APOE4 iMG，将iMG与Aβ-treated APOE3 ico共培养(图6d,e;APOE3 iCO + APOE3 iMG vs APOE3 iCO + APOE4 iMG)，然后将每个“脑组装体”用于scRNA-seq或免疫组织化学。有趣的是，scRNA-seq数据显示，与APOE3 iMG混合的APOE3 ico相比，APOE4 iMG混合的APOE3 ico中PtdSer相关基因(如PTDSS、XKR4)的表达更高(图6d)，这表明与APOE4 iMG混合的ico比与APOE3 iMG混合的ico呈现更多的PtdSer信号。我们还证实，APOE4 iMG中TREM2和APOE mRNA表达水平显著降低(图6d)，而APOE4 iMG中CD33和P2RY12 mRNA表达没有变化。免疫组织化学图像分析也证实了这一现象。与scRNA-seq分析结果一致，APOE4 iMG显示与APOE3 iMG-mixed ico相比，APOE4 iMG-mixed ico表现出更多的A -时延(D54D2)和PtdSer (PSVue)信号(图6e)。此外，我们试图通过斑块大小(MX04体积)模拟12月龄和18月龄APPNL-G-F/MAPT dKI小鼠AD疾病的进展(12月龄组1 (12M_G1)， MX04体积 1000;18个月第4组(18M_G4)， MX体积> 1000)(图6f)。有趣的是，18M_G4小鼠(比12M_G1至G3严重得多的模型)在A / n / n斑块附近的TREM2水平比12M_G2小鼠低，尽管A / n斑块水平较高(甲氧基- x04)， 12M_G2小鼠在A / n斑块附近的TREM2水平比12M_G1小鼠高(图6f)。这表明TREM2水平可以在急性(12M)时升高，但在慢性(18M)时下降，最终在慢性疾病情况下小胶质细胞失去吞噬活性。因此，我们得出结论，在散发性和家族性AD模型中都观察到TREM2的功能丧失。

图6.在散发性和家族性AD中，TREM2对ePtdSer+-A𝛽的功能缺失。

　　小 结

　　作者团队通过假设小胶质细胞对 ePtdSer+-Aβ 表现出 TREM2 依赖性行为，这些行为是在营养不良神经元和 Aβ 斑块附近产生的。使用诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的神经元和 3D 脑组件，揭示了 ePtdSer+-Aβs 是由受损神经元的营养不良神经突产生的。此外，在 2D 共培养模型或 3D 脑组装体中，基于成簇的规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）-Cas9 的 TREM2/APOE 同基因 iPSC 衍生的人 AD 小胶质细胞用于高分辨率或活细胞成像和 3D 图形渲染，以确定 TREM2 和 ePtdSer+-Aβ 之间的直接关联。研究了散发性（基于 CRISPR-Cas9 的 APOE4）和家族性（APPNL-G-F/MAPT 双敲入 （dKI））小鼠 AD 模型是否都表现出对 ePtdSer+-Aβs 缺乏 TREM2 介导的吞噬活性。最后为与 PtdSer 相关的小胶质细胞 TREM2 依赖性吞噬作用对大脑中的淀粉样蛋白斑块提供了新的见解。