导 读

　　Overview

　　失调的小胶质细胞激活导致神经炎症，是神经退行性疾病发生和进展的关键机制。近期，Nature Communications期刊发表了题为“The Human Microglia Atlas (HuMicA) unravels changes in disease-associated microglia subsets across neurodegenerative conditions”的研究性论文。小胶质细胞是大脑中的核心免疫细胞，起源于髓系前体细胞，并在胚胎期从卵黄囊迁移到大脑。它们在健康大脑中通过调节突触重塑、髓鞘形成、血脑屏障完整性和血管生成等过程维持中枢神经系统发育和功能。然而，在疾病状态下，小胶质细胞会激活并转变为促炎表型，这种失衡与多种神经系统疾病相关。早期研究通过M1/M2极化模型描述小胶质细胞激活状态，但近年来单细胞转录组学技术揭示了疾病相关小胶质细胞（DAM）亚群的存在，这些细胞在阿尔茨海默病等疾病中表现出独特的基因表达特征。单核RNA测序（snRNA-seq）技术的出现进一步推动了对人类脑组织中小胶质细胞的研究，揭示了其在多种神经系统疾病中的基因表达失调和DAM表型的跨疾病普遍性。然而，传统的M1/M2模型和DAM表型已无法完全解释小胶质细胞的复杂行为，其功能可能受到疾病类型、性别、年龄和空间定位等多因素调控。为了突破研究瓶颈，研究者通过整合来自多种神经退行性疾病的19项单核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（包括阿尔茨海默病、自闭症谱系障碍、癫痫、多发性硬化、路易体病、COVID-19患者及健康对照的241个样本），构建了人类脑免疫细胞图谱。整合后的人类小胶质细胞图谱（HuMicA）包含90,716个细胞/核，揭示了所有疾病条件下分布的9个细胞群体。此外，该团队还鉴定了4种疾病相关小胶质细胞（DAM）亚型和疾病炎症巨噬细胞（DIMs）。小胶质细胞的高度可塑性通过不同疾病中亚群分布的变化得以体现，表明其可能在疾病表型形成中发挥作用。GPNMB高表达亚群在阿尔茨海默病（AD）和多发性硬化（MS）中显著扩增，原位杂交实验进一步验证了其在AD中的增加，并引发该亚群在其他疾病中相关性的探讨。

　　结果1

　　人类小胶质细胞图谱（HuMicA）的整合

　　本研究共使用19项公开的snRNA-seq和scRNA-seq数据集（表1），涵盖诊断为AD（阿尔茨海默病）、ASD（自闭症谱系障碍）、癫痫、MS（多发性硬化）、LBD（路易体病）和重症COVID-19患者的脑组织样本，以及无神经退行性诊断个体的样本。本研究纳入的每个受试者的详细信息见SupplementaryData1。整合流程（图1a）首先独立处理每个数据集并注释主要CNS细胞类型（神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPCs）、内皮细胞和免疫细胞）（见方法部分）。随后，整合各数据集的免疫细胞簇，最终获得包含102,390个细胞/核的对象。研究者使用clustree评估所有细胞随分辨率增加的分层簇演变，提示其谱系发生特性。在最低分辨率（0.01）下观察到两个群体：T细胞簇与髓系细胞主体分离；在分辨率0.025时，髓系群体中进一步分离出表达其他CNS细胞类型标志物的额外，这些被视为双联体。构建HuMicA时，仅保留分辨率0.025下的主要髓系群体（簇0），排除T细胞和双联体。

　　HuMicA由90,716个细胞/核组成，分为9个亚群，分布于241个样本中（图1b）。整合完成后，研究者观察到各簇的细胞/核分布与方法学（scRNA-seq和snRNA-seq）、性别和样本状态（死后或手术切除组织）无关。此外，部分亚群的分布与年龄和脑组织区域显著相关，但需注意各独立数据集中这些变量的分布不均，且无法区分数据集/疾病相关效应与年龄或组织区域相关效应。鉴于计算生物学方法无法完全克服这一局限性，研究者基于小胶质细胞在不同脑区中表现出一致模式（不同于其他CNS细胞类型）的假设

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　　对最终HuMicA对象的簇分析识别出9个簇（图1b），按细胞数量从多到少编号为0至8（图1c）。除簇7外（代表边界相关巨噬细胞（MAC）——位于CNS的脑膜、脉络丛和血管周间隙），其余簇均以小胶质细胞为主，MAC的鉴定基于其标志物CD163和MRC1的上调（图1d、e）。通过计算各簇相对于其他簇的上调基因标记，生成了独特的簇特异性转录特征（图1f）。进一步将HuMicA标记基因列表与文献中的基因集交叉比对，包括：通过分选小胶质细胞与皮质组织批量测序获得的标准人类小胶质细胞转录组特征（Gosselin2017和Galatro2017），原始DAM特征基因（Keren-Shaul2017），DAM相关群体的标记基因，包括经典DAM（bona-fideDAM）；青年相关小胶质细胞（YAM）（胚胎和新生儿期富集）；疾病炎症巨噬细胞（DIMs）（由浸润单核细胞分化的类小胶质细胞，Silvin2022）。此外，整合了既往单细胞转录组研究中的小胶质细胞群体标记基因，部分数据集已纳入HuMicA。总体而言，HuMicA各簇的标记基因显示出特异性转录模式富集，表明整合分析识别的群体在外部独立数据中普遍存在，增强了研究结果的生物学可重复性。

图1   人类小胶质细胞图谱

　　表1   本研究中使用的公共数据集的总结

　　结果2

　　人稳态小胶质细胞簇

　　稳态小胶质细胞的特征主要表现为高表达所谓的稳态基因，特别是P2RY12和CX3CR1。研究者在最大的小胶质细胞簇（簇0）中主要观察到这种模式，研究者将其命名为Homeos1（图1f）。与其他研究的特征进行交叉分析（图1f）显示，簇0的表达谱与文献中对应于最大的、也被认为是“稳态”的簇的特征相关（Mic0–Mathys2019；MG2–Olah2020；d–Schirmer2019；0–Gerrits2021；MG0–Sun2023）。为了进一步表征HuMicA的每个簇，研究者根据每个簇的显著标记进行了层次簇。研究者从一个计数值矩阵中绘制了一个树状图，该矩阵由每个簇中所有细胞/核的平均表达值组成，涵盖了所有独特的簇标记。簇4和簇8与Homeos1（图2a）聚在一起，也被认为是稳态群体（分别注释为Homeos2和Homeos3）（图2b）。此外，这两个簇也显示出与Homeos1（簇0）相似的基因集富集模式（图1f）。三个稳态簇的标记列表显示出高度共享的模式。然而，每个群体也显示出特定基因的特异性上调（图2c），GRID2和SERPINE1分别是Homeos2和Homeos3的特征基因（图2c）。基因本体（GO）分析显示，三个稳态簇中GTPase显著富集。此外，Homeos3在趋化性和B细胞分化调节方面表现出特别的富集（图2d，）。

　　      为了深入了解潜在的转录因子（TF）参与情况，研究者采用了CollecTRI调节子-靶标库，基于每个稳态簇的特定差异表达来预测调节性TF的活性。先前被描述为小胶质细胞激活的重要因素的MYC活性降低，似乎是三个稳态群体共有的普遍稳态特征。此外，观察到Homeos1和Homeos2中与炎症反应相关的转录因子（NFKB1、RELA）以及其他先前与小胶质细胞激活相关的因子，如SP1、STAT1、TP53和AR的活性下调（图2e）。后者还表现出BCL6的激活，先前研究表明BCL6是促炎性巨噬细胞激活的抑制因子（图2e）。

图2  稳态小胶质细胞簇

　　结果3

　　疾病相关小胶质细胞簇

　　       疾病相关小胶质细胞（DAM）表型DAM基因特征的存在一直是表征小胶质细胞激活的黄金标准8。此外，在最近的一项研究中，Silvin及其同事在小鼠中描述了两种与DAM相关的群体，具有不同的发生学背景。一种是真正的DAM，另一种是疾病炎症性巨噬细胞（DIMs），代表一种由浸润性单核细胞衍生的类似小胶质细胞的群体。图1f的基因集富集分析表明，DAM特征在小胶质细胞簇1、3、5和6中富集；而DIM特征明确在簇2中富集。基于Keren-Shaul等人的研究，以及Thrupp等人之前对人类数据的报道，对DAM特征中完整的人类基因列表（n=210）的模块得分（MSc）表达进行评估，以及Silvin等人提供的DAM、YAM和DIMs的总结人类基因特征，进一步强化了这些模式（图3a）。在与DAM特征相关的簇中观察到YAM特征表达水平较高，突显了这两种特征之间的相似性，这构成了关于在疾病环境中获得与胚胎相关特征的假设的基础。然而，研究者的整合对象仅包含成年组织，限制了研究者对胚胎源性小胶质细胞的洞察。此外，簇1、2、3、5和6（在图3b中突出显示）呈现出特征性的基因表达特征（图3a），相应的基因本体（GO）以及使用基因集富集分析（GSEA）计算的通路富集（图3c），这些指导了研究者的注释。簇1或Inflam.DAM以TMEM163为主要标记，并且在顶级标记列表中包含SPP1，这是一种分类的DAM基因（图3a）；以及与抗原呈递、促炎信号传导（特别是干扰素、白细胞激活和细胞因子产生）以及吞噬作用相关的通路显著富集（图3c）。此外，簇1的标记在Sun等人的研究中富集于MG2炎症群体（图1f）。簇2或DIMs表现出SLC2A3和CD83的高表达（图3a），并且仅携带DIM特征，这由与白介素信号传导相关的多种促炎通路的富集所支持（图3c）。值得注意的是，簇8（Homeos3）显示出DIM特征的相对高表达，特别是在CD83、DUSP1和FOS中（图3a）。这一发现可能支持这一群体存在预激活状态的可能性，如激活相关GO术语的富集所示（图2d）。簇3和5，分别为Ribo.DAM1和Ribo.DAM2，表现出类似的富集特征，核糖体显著过表达（图3c）。此外，两者都与Sun研究中的MG3相关，称为核糖体生物发生（图1f）。然而，每个簇都有其自身的转录组特征，SYT1和PCDH9是Ribo.DAM1上调标记的主要基因，而Ribo.DAM2特异性过表达PLEKHA7和MECOM（图3a）。最后，簇6以GPNMB和PTPRG的高表达为特征（图3a），并且显示出与溶酶体、脂蛋白和脂质代谢相关的通路富集（图3c）。相应地，这一簇的特征在Sun的MG4：脂质处理中特别富集（图1f）。转录因子（TF）富集分析在揭示每个小胶质细胞群体的特定驱动因子方面并不那么精确，而是显示出区分DIMs和DAM相关簇的双重模式。上述在稳态小胶质细胞中下调的MYC，仅在Inflam.DAM（簇1）、Ribo.DAM1（簇3）和Ribo.DAM2（簇5）中富集；而DIMs（簇2）表现出JUN、SP1、NF-kB亚基、STAT1、FOS、HIF1A的增强参与，支持其整体促炎特征。最后，脂质相关小胶质细胞（Lipo.DAM，簇6）表现出过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）的独特激活（图3d）。

图3   疾病相关小胶质细胞簇

　　结果4

　　疾病相关的小胶质细胞亚群变化

　　所有HuMicA亚群在大多数受试者中均有分布，并在所有疾病情况下普遍存在。为了进一步深入了解HuMicA亚群与神经退行性疾病之间的潜在关联，研究者使用sccomp工具对每个簇在每种疾病情况下的富集情况与健康人群进行了比较分析。研究者的分析揭示了不同条件下各簇表现出的不同行为模式。簇0（Homeos1）、簇3（Ribo.DAM1）和簇8（Homeos3）在多发性硬化症（MS）、阿尔茨海默病（AD）和COVID-19中分别出现特异性减少；而簇6（Lipo.DAM）在AD和MS中扩张，簇7（MAC）仅在COVID-19中扩张（图4a和b）。值得注意的是，COVID-19作为唯一一种非神经退行性疾病，其边界相关巨噬细胞数量增加，这可能是由于这些在重症监护室因病情严重而死亡的患者出现了剧烈且全身性的急性促炎反应。为了实验验证簇6：Lipo.DAM在AD和MS中的扩张，研究者通过免疫组织化学和RNAscope原位杂交分析了人脑切片。使用泛巨噬细胞标记物IBA1来识别脑内驻留巨噬细胞，研究者在6例AD患者、8例MS患者、6例帕金森病（PD）患者和7例对照受试者中对P2RY12和GPNMB进行了RNAscope检测（图4c）。研究者的分析基于IBA1+细胞/小胶质细胞中P2RY12或GPNMB阳性点的数量。每份样本采集了10张图像，共纳入1784个细胞。研究者首先评估了每个细胞中P2RY12和GPNMB点的平均数量，尽管在AD组中GPNMB+点有轻微增加趋势，但在所研究的各组之间相似。

　　与疾病相关的小胶质细胞转录组变化也通过使用完整的HuMicA对象以及每个主要亚群（即Homeos（簇0、4和8）、DAMs（簇1、3、5和6）、DIMs（簇2）和MAC（簇7））计算疾病与健康人群的伪散差异表达基因（DEGs）进行了研究。在不同疾病中上调的DEGs总数各不相同，总体上使用HuMicA对象计算时更高（图5a）。这可能与细胞数量和伪散分析中DEGs数量之间的正相关有关，如其他地方所述，在解释DIM和MAC亚群DEGs数量较少时也应考虑这一点。通过执行Fisher精确检验来分析按疾病和细胞群体分开的多个DEGs列表之间的重叠，研究者发现不同疾病之间具有高度相似性（图5b）。在每种疾病中，分析的细胞亚群之间也观察到一致的重叠。这些结果表明，在神经疾病学中非特异性地表现出一致的疾病相关差异基因表达模式。然而，应承认在所有比较中使用相同对照群体可能引入的潜在偏差。此外，研究者还对每种疾病与对照的上调伪散DEGs列表进行了GO富集分析，考虑了完整的HuMicA对象、Homeos（簇0、4和8）、DAMs（簇1、3、5和6）以及DIMs（簇2）群体（图5c，）。对于一组GO分析，研究者发现缺乏疾病特异性，在不同疾病中通常富集。其中研究者强调了与细胞细胞骨架和细胞内运输（肌动蛋白结合、动力蛋白中间链结合、负端定向微管马达活性）以及细胞外环境（含胶原蛋白的细胞外基质）相关的通路。相反，一些结果显示出疾病特异性富集，例如在LBD中与ATP合成（质子转运ATP合成酶复合物、ATP酶复合物）和脂蛋白（富含甘油三酯的血浆脂蛋白颗粒）；在MS中与核糖体（核糖体结构成分、核糖体组装）、髓鞘（髓鞘化、髓鞘）、抗原呈递（MHC蛋白复合物）和迁移（白细胞迁移）；在COVID-19中与免疫反应（细胞因子受体活性、免疫受体活性）；以及在癫痫中与内体和肌动蛋白丝调节相关的WASH复合物（Wiskott Aldrich Syndrome蛋白和scar同源物复合物）（图5c）。总之，这些结果表明，不同疾病之间存在与疾病相关的共有机制，而其他机制可能特定于某种疾病或一小群疾病。然而，必须充分认识到这种伪散分析中统计伪影的潜在性，由于其自身性质，在像HuMicA这样的异质性整合单细胞对象中更容易受到批次效应的影响。

图4   小胶质细胞亚群分布的差异

图5    伪散差异表达基因

　　讨论

　　Disscussion

　　本研究旨在通过整合来自多种神经退行性疾病和健康受试者的单核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，构建一个综合的多疾病人类小胶质细胞图谱（HuMicA）。主要目标是表征小胶质细胞亚群的异质性及其在不同疾病背景下的变化。HuMicA图谱使用19个公开可用的数据集构建，涵盖了241个样本，包括阿尔茨海默病（AD）、自闭症谱系障碍（ASD）、癫痫、多发性硬化症（MS）、路易体病（LBD）、COVID-19患者以及健康对照。该图谱包括90,716个细胞核/细胞，揭示了9个不同的小胶质细胞亚群，其中八个是小胶质细胞，一个是边界相关巨噬细胞（MAC）。研究还分析了小胶质细胞亚群的表征，确定了三个稳态小胶质细胞簇（Homeos1、Homeos2、Homeos3），其特征是高表达P2RY12和CX3CR1。Homeos1是最丰富的，而Homeos3规模较小，可能代表预激活状态；发现了四个与DAM相关的亚群（Inflam.DAM、Ribo.DAM1、Ribo.DAM2、Lipo.DAM）和疾病炎症巨噬细胞（DIMs）。这些亚群表现出与激活和炎症相关的不同转录组特征。通过计算每种疾病的伪散差异表达基因（DEGs），发现不同疾病之间存在高度重叠，表明非特异性的激活模式；GO富集分析显示了共享和疾病特异性的机制。共享机制包括细胞细胞骨架和细胞内运输，而特定机制则在LBD、MS、COVID-19和癫痫中有所体现。HuMicA图谱详细表征了小胶质细胞亚群及其在各种神经退行性疾病中的变化，突显了小胶质细胞行为的复杂性和异质性。该研究强调了进一步研究不同小胶质细胞亚群在疾病进展中的具体作用的必要性，并探索它们作为潜在治疗靶点的可能性。HuMicA作为未来健康和疾病状态下小胶质细胞研究的宝贵资源，有助于深入理解其在神经疾病学中的贡献。

　　原文链接：Martins-Ferreira, R., Calafell-Segura, J., Leal, B. et al. The Human Microglia Atlas (HuMicA) unravels changes in disease-associated microglia subsets across neurodegenerative conditions. Nat. Commun. 2025, 16, 739.