肿瘤浸润性淋巴细胞 (Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs) 是指离开血液进入到肿瘤中的淋巴细胞，为肿瘤微环境中的一大重要组成部分。近十年来，TILs愈来愈受关注，因为科学家们发现这些细胞可识别非特定的多种癌细胞。因此对TILs的基因标志物及相关蛋白的分析，为我们提供线索了解癌症疾病的进展，对肿瘤预后或预测具有重要意义，甚至可成为一项细胞治疗的手段。
TILs 在肿瘤微环境的作用
由于在肿瘤中T细胞的存在和功能有不少争议，因而近期的研究数据在多种不同肿瘤类型中强调肿瘤免疫浸润中细胞成分的多样性，如B细胞，NK细胞，M1和M2巨噬细胞，粒细胞或肥大细胞。控制癌症进展中，是T细胞或B细胞起作用一直存在着争议。用抗体进行肿瘤治疗期间，NK细胞的抗肿瘤免疫活性主要来自于抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)起作用。TIL细胞中存在B细胞也视为预后的生物标志物，浸润性NK细胞也被证实具协同抗肿瘤效果。而今，这些免疫细胞的协同相互作用，才真正是对抗肿瘤反应的关键点，因此肿瘤免疫研究与肿瘤免疫治疗方法学是当今热门领域。
Tumor microenvironment and immune cells.
Adapted fromhttps://www.intechopen.com/
CD8+ T细胞
CD8+ T细胞，又称细胞毒性T细胞 (CTL)，为公认的主要抗肿瘤免疫效应性细胞。CD8+ T细胞表面的MHC I可专一辨识肿瘤相关抗原，与肿瘤细胞结合后产生穿孔素与其他细胞毒素，杀死癌细胞但不影响正常细胞。但由临床观察到，在肿瘤微环境中可辨识肿瘤原位或外周血中的抗原表位的CD8+ T细胞常常被消灭。已证明这些CD8+ T细胞膜上被结合了肿瘤细胞分泌的FasL 或PDL-1或TGF-β，而促使TIL中抗肿瘤效应性的CD8+ T细胞凋亡；抑或肿瘤抗原丢失、MHC I分子下调、进而使肿瘤逃逸宿主免疫系统。这影响了所有T细胞响应防止过度活化和组织损伤。如肿瘤细胞表达的PD-L1可藉由激活 PD-1/PD-L1讯息途径降低T细胞增殖，存活和产生细胞因子。
CD4+辅助性T细胞
CD4+辅助性T细胞（Th）提供细胞因子介导帮助CTL增殖与提高它的毒杀性，存在于实体肿瘤的频率高于CD8+ T细胞，包括Th1、Th2、Th17与调节性T细胞 (Treg)几个亚型。Th1分泌IL2 和INF-γ，起到活化与促进CD8+ T细胞与NK 细胞增殖。Th1亦影响树突状细胞 (DC)的抗原呈递功能。相反地，Th2会促使B细胞成熟，克隆增殖 (clonal expansion) 和类别转换，因而增进体液免疫应答 (Humoral immune reaction) 。此 “Th1/Th2” 平衡模式与比值经常在癌症和其他疾病发生改变，癌症患者的血液和肿瘤组织中的Th2细胞数量往往多过Th1细胞。因此，Th1/Th2比例也常用于预测有无转移生存率，并提示在肿瘤微环境发生的免疫应答唯一重要的预后因素。
调节性T细胞
调节性T细胞(Treg)仅占CD4+辅助性T细胞亚群中的~5%，但对于调节原位免疫反应发挥重要作用。在不同肿瘤中可发现，肿瘤细胞可将Treg招集到肿瘤微环境中，因此Treg的存在与功能似乎与癌症的预后成反比。人源Treg缺乏明确的表型分类，自然Treg细胞 (natural Treg，nTreg) (CD4+CD25highFOXP3+) 可控制癌症相关的炎症发生；诱导Treg细胞 (induced Treg, iTreg) 似乎下调原位肿瘤反应，促进癌细胞生长。
B细胞
B细胞起源于骨髓，后迁移至淋巴器官，在被抗原激活后产生抗原特异性抗体的浆细胞，从而介导体液抗肿瘤免疫。在人类实体瘤中的TILs细胞群中亦含有不等比例的浸润性B细胞。虽然临床研究中多倾向于观察T细胞应答，但浸润性B细胞的作用也愈来愈受重视。无论是对乳腺癌，非小细胞肺癌（NSCLC）和直肠癌（CRC）化疗均有反应，被证实为可做预后生物标志物。
NK细胞
NK细胞因為无MHC、HLA限制‚不依赖抗体‚其非專一性的細胞毒殺作用而被称为自然杀伤活性。可识别消除肿瘤细胞，释放穿孔素、颗粒酶和细胞因子，亦是强效的INF-γ产生细胞。然而临床结果显示，肿瘤微环境中NK细胞几乎与实体肿瘤没有正向关联，即使NK细胞的抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)可起抗肿瘤活性；似乎暗示着NK细胞的功能在癌症中被下调，此种损坏预示着肿瘤的进展和不良预后。
TILs可至少分成三个不同的细胞类型：效应性细胞、调节细胞和炎性细胞；他们都可通过细胞因子和可溶性因子相互影响。肿瘤细胞本身也产生免疫抑制性细胞因子，对微环境中免疫细胞的召集具有直接作用。因此，肿瘤微环境中的细胞组成以及微环境内的细胞与细胞因子的相互作用决定了抗肿瘤免疫应答的结果。肿瘤微环境的构成与细胞因子会随着癌症进程变化，因此其中的细胞组成TILs也会随之变化。这便依赖着调节细胞与炎性细胞TILs的平衡来侦测与治疗癌症患者，也因此有了TIL细胞疗法研发，生产以及商业化，用以治疗多种癌症。
美天旎在肿瘤微环境与肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)研究提供多元解决方案
前期文章 已提及如何解离人源肿瘤组织并获取高纯度的肿瘤细胞，使用CD45（TIL）磁珠专门分离富集肿瘤组织中的TILs 以供下游分析。此外，美天旎独特REAlease® MicroBeads可帮助分选富集特定TILs细胞族群并且保留细胞表面抗原决定部位(cell surface epitopes)，如CD3（TIL）REAlease® MicroBeads可分选CD3+ T细胞亚型与natural killer T 细胞。CD4 (TIL), REAlease® MicroBeads 可用于分离富集CD4+辅助性T细胞与微量单核细胞及树突状细胞。CD8 (TIL) REAlease® MicroBeads则可分选细胞毒性T细胞。
REAlease® MicroBeads
Magnetic cell isolation with reversible cell labelling
可逆的细胞标记磁性分选
· Label-free cells with epitopes available for downstream applications
· Bead-free cells for consecutive magnetic isolation
· Isolation of cell subsets of interest
REAlease®MicroBeads作用原理
REAlease技术依赖于在单体状态下对表位(epitope)亲和力低的抗体片段；当在生物素化REAlease 复合物（ biotinylated REAlease Complex）中形成多聚体时，这种复合物即以高亲和力结合到目标细胞表位。
与REAlease MicroBead结合一起，目标细胞被磁性标记。在磁性分选过程中，标记的目标细胞被保留在柱内，从而与未标记的细胞分离。
为了获得不含磁珠（MicroBead-free）的目标细胞，在洗脱过程中，将REAlease释放试剂(REAlease release reagent)施加到柱上。洗脱后的目标细胞则不含REAlease，随后可用于第二轮磁性分选，例如使用常规的MACS MicroBeads。
加REAlease释放试剂可获得无标记（Label-free)目标细胞。这导致抗体片段的单体化和复合物从细胞表面分离。结果：没有任何标记的细胞，他们的表位完全可以重新标记，并做任何下游应用分析。
