RNA 干扰（RNAi）技术凭借其靶标特异性强、环境友好等优势，已成为农业害虫防治领域的研究热点，2024 年 RNA 基农药被评为 “科学突破年度成果”，且 GreenLight Biosciences 的 RNA 基农药 Calantha 获美国 EPA 批准，标志着该领域的重大进展。然而，以双链 RNA（dsRNA）为基础的农药在实际应用中面临多重关键挑战，严重限制了其规模化推广。

　　在稳定性方面，dsRNA 易被环境核酸酶和昆虫肠道酶降解，尤其在具有刺吸式口器的半翅目害虫中，口服递送的 dsRNA 稳定性极差。在递送效率上，不同昆虫物种对 dsRNA 的摄取、加工和系统传播能力差异显著，且 dsRNA 跨细胞膜递送效率低，往往需要高剂量才能实现有效基因沉默，既增加成本又提升脱靶风险。在生产应用层面，传统 dsRNA 生产系统存在规模化难度大、成本高的问题，同时化学修饰或脂质等载体介导的递送策略可能引入毒性、降低活性或存在结构异质性等缺陷。SARNs

　　基于核酸纳米组装体在结构可塑性、自组装特性及抗核酸酶降解方面的优势，研究团队受 tRNA 等天然 RNA 稳定三维结构的启发，开发出工程化自组装 RNA 纳米结构（基于天然 RNA 基序（三向 / 五向支架、发夹环等），设计 4 种 SARNs 变体（SARN3w、以赤拟谷盗为模型，靶向 EcR 和将 Cy3 标记的 SARNs 通过水稻介导递送褐飞虱，观察植物体内转运（荧光成像）与害虫肠道分布，量化基因沉默效率与死亡率，评估田间应用可行性。构建 T7 启动子驱动的表达载体，在大肠杆菌 HT115 中实现自动诱导表达；通过 RNASwift 提取与冷冻干燥制备 SARNs 粉剂（粒径 3.87-7.01μm），优化生产工艺并进行成本核算。检测 SARNs 在不同温度（≤55℃）、UV 照射、pH 值及植物汁液中的稳定性，评估粉剂的储存与运输特性，完成实验室数据向田间应用的转化分析。利用 BLOCK-iT™ RNAi Designer 筛选 siRNA 序列，通过 Mfold 预测二级结构，SimRNAweb 模拟三维构象；采用 T7 RiboMAX™系统进行体外转录，经变性 PAGE 纯化后退火组装。采用将 SARNs 编码序列克隆至 pET23a 载体，转化大肠杆菌 HT115（DE3），通过氨苄青霉素筛选阳性克隆。采用 Talos F200C 冷冻电镜观察 SARN3w 的三维形态，使用 Hitachi Regulus 8100 扫描电镜分析冻干粉剂的形貌。通过 Agilent 1260 Infinity II HPLC 系统（DNAPac RP 柱）分析疏水性（保留时间）；利用动态光散射（DLS）测定粉剂粒径分布（D10/D50/D90）。将 SARNs 与 dsRNA 分别暴露于不同 pH（4.0-10.0）、温度（25-55℃）、UV 照射及植物汁液中，通过 Native PAGE 检测降解情况。赤拟谷盗（GA-1 品系）饲养于含 5% 酵母粉的全麦粉培养基（28℃），褐飞虱饲养于水稻幼苗（28℃，14L:10D 光周期）；采用显微注射（0.1-0.2μL / 个体）或植物介导递送（水稻浸泡 RNA 溶液）进行处理。每日记录幼虫死亡率，72 小时后通过 RT-qPCR 测定靶基因表达量；观察蜕皮障碍、体色改变等表型，通过统计分析（Log-rank 检验、单因素方差分析）比较组间差异。合成 Cy3 标记的 RNA，通过荧光显微镜（Nikon Eclipse 80i）观察其在植物茎 / 叶及昆虫肠道、脂肪体中的分布与滞留情况。采用含乳糖的自动诱导培养基培养工程菌，6 小时诱导后通过 RNASwift 法提取 RNA（无需酚 / 氯仿），经异丙醇沉淀纯化。将 RNA 浓缩液冷冻干燥制备粉剂，通过 IP-RP HPLC 验证纯度，测定重溶后浓度与活性保留率。基于 500mL 发酵体系，统计原料、耗材及人力成本，与传统 dsRNA 生产工艺进行对比分析。），旨在突破现有 RNAi 农药的技术瓶颈。

　　技术路线

　　SARNs 分子设计与表征：SARN5w、SARN3w-2x、SARN5wt），整合 3-5 种 siRNA duplex；通过冷冻电镜、IP-RP HPLC、RNase III 消化实验验证其结构完整性、疏水性及稳定性。

　　基因沉默效率验证：TcCht10基因，通过注射递送评估不同 SARNs 的基因敲降效率（RT-qPCR）与致死率；以褐飞虱为模型，设计 SARN3w-NlY-W-F 多基因靶向载体，验证表型改变与基因沉默的关联性。

　　植物介导递送验证：

　　规模化生产与制剂开发：

　　环境稳定性与田间适配性测试：

　　研究方法

　　SARNs 设计与合成：

　　基因表达分析：TRIzol法提取 RNA，通过 FastKing One-Step RT-qPCR Kit 合成 cDNA，使用 Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 进行定量分析，以 RPS6（赤拟谷盗）和 RPS15（褐飞虱）为内参基因，采用 2⁻ᵃᵃᶜᵗ法计算相对表达量。

　　载体构建与菌株转化：

　　微观结构观察：

　　理化性质分析：

　　稳定性评估：

　　昆虫模型实验：

　　基因沉默与毒性评估：

　　体内转运追踪：

　　发酵与提取：

　　制剂制备：

　　成本核算：

　　研究结果

　　SARNs 的分子设计与理化特性验证结果

　　结构组装与表征：基于天然 RNA 基序的自下而上设计策略，成功构建 4 种 SARNs 变体（SARN3w、SARN5w、SARN3w-2x、SARN5wt），均能从单链 RNA 自折叠形成紧凑纳米结构。其中 SARN3w 直径 14 nm、SARN5w 直径 16 nm，处于 10-20 nm 的最优生物递送尺寸范围，经冷冻电镜证实呈三向连接的预期结构。IP-RP HPLC 分析显示，所有 SARNs 的保留时间均长于其线性化对照，其中 SARN3w 延迟 1.7 min，疏水性增强最为显著，为细胞摄取提供有利条件。

　　稳定性与降解特性：RNase III 消化实验表明，含突出端基序的 SARN3w 和 SARN5w 降解速率显著慢于 dsEcR（dsEcR 1 h 内完全降解，SARNs 20 h 内逐步释放 21 nt siRNA 片段）；而去除突出端的 T4 连接变体（SARN3w-T4、SARN5w-T4）几乎不被降解，证实突出端基序介导酶促加工，发夹环结构延长 siRNA 稳定性的双重机制。

　　SARNs 在咀嚼式口器害虫中的基因沉默效果

　　以赤拟谷盗（Tribolium castaneum）为模型，靶向蜕皮激素受体（EcR）和几丁质酶 10（TcCht10）基因的实验结果显示：

　　高效基因敲降：注射 SARN3w 的 2 龄和 6 龄幼虫 EcR mRNA 表达量分别降低 94.9% 和 86.9%，显著高于 dsEcR 组的 51.9% 和 44.9%；SARN3w-TcCht10 对 TcCht10 的沉默效率达 96.0%，均表现出强效靶向抑制作用。

　　高致死率与典型表型：SARN3w 和 SARN5w 处理 7 天后，2 龄和 6 龄幼虫死亡率分别达 66.3% 和 63.8%，是 dsEcR 组的 1.6-2.8 倍；SARN3w-TcCht10 处理组死亡率达 95.0%。表型观察显示，幼虫出现生长停滞、体色加深、蜕皮障碍（蛹期旧表皮滞留）等典型发育异常，最终死亡。

　　结构对活性的影响：含突出端基序的 SARN3w、SARN5w 较无突出端的 SARN3w-2x、SARN5wt 起效更快（72 h 内生存率显著下降），且 SARN3w 因更高的结构灵活性（臂角可在 25°-165° 变化），在肠道和脂肪体中分布更广泛，荧光信号强度显著高于 dsRNA 组。

　　SARNs 在刺吸式口器害虫中的基因沉默效果

　　以褐飞虱（Nilaparvata lugens）为模型的实验结果表明：

　　多基因靶向验证：SARN3w-NlY-W-F 同时靶向 NlYellow、NlWhite、NlFoxO 基因，沉默效率分别达 97.5%、98.5% 和 57.3%，72 h 内出现体色黄化、眼色变白、长翅型分化等特征表型，证实各结构分支可独立发挥基因沉默作用。

　　EcR 靶向的防治效果：SARN3w-NlEcR 对 NlEcR 的沉默效率达 94.1%，是 dsNlEcR 组的 1.6 倍；7 天死亡率达 72.7%，较 dsRNA 组提升 50%，且出现明显蜕皮失败表型。

　　植物介导递送的有效性：Cy3 标记的 SARN3w-NlEcR 在水稻茎、叶中荧光信号更强且持续时间更长（叶片中 7 天达峰，茎中 14 天仍显著高于 dsRNA 组）；褐飞虱取食后 48 h，仅 SARN 处理组在中肠检测到荧光信号，最终死亡率达 100%，较 dsRNA 组（66.7%）提升 50%。

　　SARNs 的规模化生产与制剂性能结果

　　高效发酵与提取：通过大肠杆菌 HT115（DE3）自动诱导表达，SARN3w 和 SARN5w 产量分别达 3029.52±216.96 ng/μL 和 2846.70±139.57 ng/μL，发酵液产量达 12.12±0.87 μg/mL 和 11.39±0.68 μg/mL，显著高于传统 dsRNA 的 4 μg/mL。RNASwift 提取法无需酚 / 氯仿，可快速获得高纯度产物，IP-RP HPLC 证实其与体外转录产物保留时间一致（SARN3w 10.9 min，SARN5w 12.7 min）。

　　制剂稳定性与活性保留：冻干粉剂粒径为 3.87-7.01 μm，重溶后浓度达 2453.91±175.84 ng/μL（SARN3w）和 2135.02±104.64 ng/μL（SARN5w），活性保留率超 80%。环境稳定性测试显示，SARN3w 在 pH10.0 条件下 12 h 仍可检测，而 dsRNA 快速降解；在植物汁液中 48 h 仍保持完整，dsRNA 24 h 即显著降解。

　　口服递送有效性：赤拟谷盗取食含 SARN 粉剂的饲料后，EcR 表达量降低 55.6%，最终生存率仅 43%；肠道解剖证实粉剂成功被摄入，证实口服递送的可行性。

　　成本与应用潜力分析结果

　　经济核算显示，SARN 浓缩液和粉剂的生产成本分别为 0.10 美元 /mg 和 0.13 美元 /mg，显著低于传统 dsRNA 生产工艺；siRNA 单位成本从 dsRNA 的 32.15 美元 /μmol 降至 SARN 平台的

　　讨论与分析

　　SARNs 的技术优势与作用机制

　　结构设计主导性能提升：SARNs 的核心优势源于模块化设计 —— 三向 / 五向支架提供结构稳定性，突出端基序启动 RNase III 快速消化以释放 siRNA，发夹环则保护剩余 siRNA 实现持续释放，形成 “即时起效 - 长效维持” 的作用模式。其中 SARN3w 因 14nm 粒径（处于 10-20nm 的最优递送范围）、高疏水性及 25°-165° 的臂角灵活性，表现出最高基因沉默效率（EcR 敲降率 94.9%），证实结构参数与生物活性的强关联性。

　　跨物种递送的关键因素：对于咀嚼式口器的赤拟谷盗，SARNs 通过肠道上皮细胞的 EPR 效应增强吸收；对于刺吸式口器的褐飞虱，其橡胶状变形能力使其能穿透植物维管系统并在昆虫中肠富集，解决了传统 dsRNA 在刺吸式害虫中递送低效的难题。

　　生产与应用的可行性分析

　　规模化生产的突破：通过大肠杆菌自动诱导表达，SARNs 产量达 11.39-12.12μg/mL 发酵液，较传统 dsRNA 生产提升近 3 倍；RNASwift 提取法缩短了纯化时间并降低降解风险，冻干粉剂重溶后活性保留率超 80%，满足田间应用对稳定性与量产的需求。

　　成本优势的核心来源：摒弃 IPTG 诱导改用乳糖自动诱导，减少毒性与成本；单链 RNA 自组装无需严格浓度配比，降低工艺复杂度；siRNA 装载量高（3-5 个 / 纳米结构），单位活性成本显著降低，为商业化推广奠定基础。

　　现存挑战与未来方向

　　待解决的关键问题：目前研究局限于实验室条件，田间复杂环境（微生物降解、雨水冲刷）对 SARNs 稳定性的影响尚未明确；对天敌等非靶标生物的长期影响需进一步评估；喷雾递送等田间施用方式的适配性有待优化。

　　潜在优化路径：可通过引入表面修饰（如生物黏合剂）提升叶面附着性，或开发土壤移动型纳米载体增强根系吸收；结合 AI 设计优化 SARNs 结构，进一步提升跨物种靶向性与抗降解能力；探索与生物防治剂、作物轮作等现有农业措施的协同应用模式。

　　多领域拓展潜力：SARNs 的可编程性使其可装载抗逆基因相关 siRNA 用于作物改良，其生物相容性与低毒性特性在肿瘤 RNA 疗法递送等生物医药领域也具有广阔应用前景，未来可通过跨学科合作挖掘更多功能价值。